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2016年12月CRISPR/Cas重大进展梳理

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基因组编辑技术CRISPR/Cas9被《科学》杂志列为2013年年度十大科技进展之一,受到人们的高度重视。CRISPR是规律间隔性成簇短回文重复序列的简称,Cas是CRISPR相关蛋白的简称。CRISPR/Cas最初是在细菌体内发现的,是细菌用来识别和摧毁抗噬菌体和其他病原体入侵的防御系统。

小编汇总列举了最近一段时间CRISPR基因编辑系统取得的重大进展,详情如下所示(文末附全部文献下载链接)。

1. Development:利用改进的CRISPR基因编辑平台研究人类发育

doi:10.1242/dev.138081

在一项新的研究中,来自英国韦尔科姆基金会桑格研究所和剑桥大学的研究人员构建出一种更加高效的和可控的CRISPR基因组编辑平台:sOPTiKO。他们描述了这种免费获得的单步骤系统如何在体内每个细胞和每个发育步骤中发挥作用。这种新方法将有助科学家们开展发育生物学、组织再生和癌症研究。


两种互补的方法被开发出来。sOPiTKO是一种通过破坏DNA关闭基因的敲除系统。sOPTiKD一种通过破坏RNA沉默基因作用的敲降系统。利用这两种方法,科学家们能够可诱导性地在任何一种细胞类型中和在细胞—从干细胞到完全分化的成体细胞—的任何发育阶段上关闭或沉默基因。这将允许全世界的科学家们快速地和准确地研究当这些细胞发育成肝脏、皮肤或心脏等组织时基因在这种变化中所发挥的作用,并且发现这如何促进健康和疾病产生。


人体含有大约37万亿个细胞,但是人类基因组仅含有大约2万个基因。因此,为了产生体内的每个组织和细胞类型,不同基因组合必须在器官或组织发育的不同时刻发挥作用。在细胞发育的特定时刻能够关闭基因将允许人们研究它们所起的作用。

2. Nat Genet:利用CRISPR/Cas9让番茄植物更早开花结果
doi:10.1038/ng.3733
在一项新的研究中,来自美国冷泉港实验室(CSHL)的一个研究团队利用一种简单而又强大的调整两种流行的番茄植物品种中的基因的CRISPR/Cas9基因组编辑方法,开发出一种快速的方法使得它们比当前的商业品种早两个星期开花和结出成熟的果实。


在这项新的研究中,Lippman和他的同事们揭示出相对于南美洲的野生近缘种,如今的栽培番茄植物为何对一天的光照时间不是非常敏感。在某种程度上,栽培植物是否有12小时或16小时光照并不是非常重要;它们在种植之后几乎在相同的时间点开花。


Lippman和同事们追踪到栽培番茄植物的日照时间敏感性丢失是由于基因SP5G(SELF PRUNING 5G)发生突变。它是成花素和抗成花素基因家族的一个成员。


通过将来自加拉帕戈斯群岛的这种野生番茄植物在纽约市的温室和田间种植,Lippman和同事们观察到SP5G基因编码的抗成花素激素在表达和活性上发生显著激增,从而导致开花时间大幅延迟。相反之下,在栽培番茄植物中,这种抗成花素激素激增要弱很多。


Lippman说,他的团队的主要创新—基于栽培番茄品种,培育出樱桃番茄(cherry tomato)和罗马番茄(roma tomato)品种:它们要比这些栽培番茄品种更早地开花—源自他们观察到尽管栽培番茄植物对日照时间非常不敏感,但是“抗成花素基因SP5G仍然存在一些残余表达”。


这让Lippman团队利用基因编辑工具CRISPR/Cas9诱导SP5G基因发生微小突变,其目的在于让这种基因完全失活,这样它根本不会产生任何抗成花素蛋白。


当将这种经过基因编辑的SP5G基因版本导入流行的樱桃番茄和罗马番茄品种时,它们更早地开花,因而使得它们的果实更早地成熟。调整另一种让番茄植物以一种密集的紧凑的类似灌木丛的方式生长的抗成花素基因使得这些较早开花的番茄品种长得更加紧凑和早实丰产。


3. Plant Cell Physiol:新方法让CRISPR/Cas9高效地敲除拟南芥中的靶基因
doi:10.1093/pcp/pcw191

在一项新的研究中,来自日本名古屋大学转化生物分子研究所的两名生物学家Hiroki Tsutsui和Tetsuya Higashiyama开发出一种新的载体(一种转运遗传信息的载体),从而允许高效地和可遗传地敲除模式植物拟南芥中的靶基因。


对拟南芥而言,CRISPR/Cas9的突变诱导效率在某种程度上一直都比较低。这是因为诱导基因突变的Cas9是在细胞的发育阶段后期被激活的。因此,为了获得所需的靶基因被敲除的植物物种,人们就需要大量的时间、精力和植物物种。


通过使用RPS5A基因—在植物细胞的胚胎发育初期表达—的启动子,研究人员能够诱导Cas9高效地敲除植物卵细胞中的基因。这个RPS5A启动子在卵细胞中是有活性的,因此他们决定将这个分子工具称为pKAMA-ITACHI Red(pKIR)载体。相对于在植物中经常使用的35S启动子,该分子工具能够高效地编辑植物基因组。


Higashiyama团队发现利用pKIR载体表达Cas9对拟南芥基因组进行高效编辑的方法能够敲除早期发育阶段期间的细胞中的基因,并且诱导能够传递到下一代的子细胞中的突变。


4. 张锋再发CRISPR新突破!“魔剪”可实现同时编辑4个基因
doi:10.1038/nbt.3737


12月5日,Nature Biotechnology杂志在线发表了题为“Multiplex gene editing by CRISPR–Cpf1 using a single crRNA array”的研究成果。CRISPR先驱张锋以及Wageningen大学的John van der Oost是这篇论文的共同通讯作者。


近几年,CIRSPR技术飞速发展,除了“元老”CIRSPR/Cas9系统,科学家们还找到了一些新“选手”。2015年9月,张锋研究组在Cell杂志上发表的一篇论文中首次提出了新型基因编辑系统CRISPR/Cpf1。Broad研究所Eric Lander教授称,该研究证明了Cpf1在编辑人类基因组中非凡强大的功能。


在这项新研究中,科学家们发现,CRISPR/Cpf1系统能够克服Cas9靶向多个基因位点的限制。研究表明,Cpf1加工自身CRISPR RNA (crRNA)的能力可用于简化多重基因组编辑。使用单个定制的CRISPR阵列(array),研究人员实现了在哺乳动物细胞中同时编辑多达4个基因,在小鼠大脑中同时编辑3个基因。


5. IJBCB:利用CRISPR/Cas9移除β细胞中的HAT酶增加胰岛素产生
doi:10.1016/j.biocel.2016.10.022

在一项新的研究中,在基因剪刀CRISPR/Cas9的帮助下,来自瑞典隆德大学糖尿病中心的研究人员成功地“关闭”一种经证实在调节糖尿病相关基因TXNIP中发挥着关键作用的酶。结果是这些经过基因修饰的胰腺β细胞增加胰岛素产生,而且它们的死亡率下降。


在此之前,研究人员已对一类被称作组蛋白乙酰转移酶(HAT)的酶进行分析,其中HAT在调节基因TXNIP中发挥着至关重要的作用。在高血糖水平情形下,TXNIP导致β细胞死亡,并且降低胰岛素产生。


在这项新的研究中,研究人员对来自2型糖尿病患者和来自健康人的产生胰岛素的胰岛进行比较,结果发现糖尿病β细胞中的HAT基因活性比健康β细胞高出2倍。在这项发现后,他们的目标就是移除这种酶的基因功能来研究它对糖尿病的影响。经证实,这种思路是成功的。


利用CRISPR/Cas9,研究人员能够移除遗传密码中控制来自大鼠的产生胰岛素的细胞中的HAT酶功能的序列。这导致TXNIP基因活性下降,因而降低细胞死亡和增加胰岛素产生。


6. Nat Med:利用CRISPR-Cas9进行全基因组筛选找到胰腺肿瘤弱点
doi:10.1038/nm.4219

最近,来自加拿大多伦多大学的研究人员在RNF43突变的胰腺导管腺癌(PDAC)细胞中进行了全基因组范围的CRISPR-Cas9筛选,并找到了可以用于治疗该类型癌症的潜在抗体药物。这种类型的PDAC依赖Wnt信号进行增殖。

在这项研究中,研究人员通过筛选发现一个有FZD5参与的Wnt信号通路对于携带RNF突变的PDAC细胞的增殖有重要作用,FZD5是人类基因组编码的10个Frizzled受体中的一个。研究结果表明该Wnt受体的表达水平存在背景依赖性特征。研究人员利用一组重组抗体检测FZD蛋白的表达,证实FZD5的功能特征无法通过蛋白表达情况来解释。

除此之外,研究人员还发现特异性结合FZD5和FZD8的抗体能够大大抑制RNF43突变PDAC细胞的体外生长,并且在肿瘤异种移植模型中也有类似作用,这为他们在基因筛选过程中观察到的功能特性提供了支持。携带RNF43突变的病人来源PDAC细胞系也会受到FZD5抗体的选择性抑制,进一步表明这种抗体可以用作治疗PDAC的潜在靶向疗法。研究人员还在肿瘤类器官培养实验中发现携带RNF43突变的结直肠癌肿瘤也对FZD5抗体敏感,说明基于PDAC发现的现象存在更广泛的潜在应用方向。

7. 科学家首次利用CRISPR/Cas9技术成功纠正小鼠的凝血功能

CRISPR/Cas9,一把强大的基因魔剪,其在有效纠正引发疾病的突变上表现出了巨大潜力,近日,在圣地亚哥举办的第58届美国血液学会年会和博览会上,来自宾夕法尼亚大学的研究人员通过研究首次开发出了一种双基因疗法,其能够将CRISPR/Cas9介导的基因靶向系统的关键组分运输到小鼠机体中来治疗B型血友病(Hemophilia B),这是一种第九因子缺乏症,该疾病通常是由于凝血蛋白缺失或缺陷引发。

医学博士James M Wilson指出,基本上来讲我们能够治愈小鼠,为了证实这种新方法,研究者对血凝因子IX缺失的小鼠模型进行实验,他们利用了两种载体方法,第一种载体能够表达肝脏特异性启动子驱动的SaCas9基因,从而基因编辑工具就能够安顿到肝脏中,肝脏是产生血凝因子IX的场所,而第二种载体与此前基于CRISPR的基因疗法并不相同,其包含了一种RNA序列,该序列能够特异性靶向作用IX基因和IX cDNA序列外显子2的5‘端区域,这就明显增强了该方法的潜力和准确性。

研究者利用腺病毒相关载体将这些组分运输到了小鼠的肝脏细胞中,这种策略是基于CRISPR介导的同源重组,能够将人类的cDNA插入到小鼠基因组中的IX位点。研究者Wang说道,靶向性的插入就能够在天然小鼠因子IX启动子控制下引发嵌合活性因子IX蛋白的表达。在新生小鼠和成体敲除小鼠中增加注射的两种载体的剂量就表明,稳定因子IX的活性能够持续表达超过4个月,在载体疗法8周后,新生小鼠和成体敲除小鼠亚群就会进行部分肝脏切除,而且其都会在没有任何并发症的情况下存活,同时会继续表达相同水平的IX因子。

8. 中国学者祁庆生教授:基于CRISPR-Cas9一步式改造细菌基因组
doi:10.1038/srep37895

11月24日,在《Scientific Reports》发表的一项研究中,山东大学生命科学学院的祁庆生教授带领的研究小组,描述了一个CRISPR-Cas9辅助的非同源末端连接(CA-NHEJ)策略,用于细菌基因高效而快速的失活——以一种不依赖同源重组的方式,并无需无选择标记的使用。

在这项研究中,研究人员描述了一个CRISPR-Cas9辅助的非同源末端连接(CA-NHEJ)策略,用于细菌基因高效而快速的失活——以一种不依赖同源重组的方式,并无需无选择标记的使用。该研究表明,CA-NHEJ可以用来一步式地删除大的染色体DNA片段,而无需同源DNA模板。因此,它是一种新的和功能强大的工具,用于细菌基因组编辑,并具有加速基因组进化的潜力。

9. Oncotarget:新研究借助CRISPR/dCas9技术唤醒沉睡的抑癌基因
doi:10.18632/oncotarget.11142


根据澳大利亚研究人员的一项最新进展,让我们的基因从体内摧毁癌细胞,这样就可以不吃药治癌症了。研究人员使用基因编辑技术CRISPR/dCas9唤醒关键的肿瘤抑制基因从内部摧毁癌症。该研究团队主要聚焦在将该技术应用于乳腺癌和肺癌细胞,也研究了对胃肿瘤细胞的潜在效果。

“我们体内每天都会产生癌变细胞,但是机体有非常高效的DNA损伤识别系统,发现损伤之后就会进行修复或执行自我摧毁程序。”Dr. Benjamin Garcia-Bloj这样说道。

肿瘤抑制基因能够对细胞进行检查确保细胞没有任何损伤和突变,并且不会出现生长失控,因此这些基因是机体清除癌变细胞实现自我治愈的关键。

“如果未来可以通过重新激活或者说‘唤醒’这些肿瘤抑制基因,让它们去执行治疗疾病的工作那就太好了。这样就可以不用吃药还能治疗疾病,传统的癌症治疗方法中使用的药物经常会对身体产生不良影响。”Dr. Garcia-Bloj这样说道。

“细胞有一些机制可以防止正常细胞变成癌细胞,只是在人们患上癌症以后一些肿瘤抑制基因会被沉默。我们开发的这种治疗方法可以让细胞重新记起如何激活这些机制来阻止癌症扩散。”

在此之前科学家们曾使用CRISPR技术激活一些沉默的基因,但是直到现在激活率仍然非常低。

“我们能够在体外实验中促进基因表达使其表达活性增加22000倍,并可以阻止癌细胞生长,不过该技术目前仍处于概念验证阶段,距离真正的临床试验还有许多年。我们还需要进行动物研究,希望能够在活体肿瘤中通过激活多个基因获得相同的结果。”

10. Cell新文章:两种新型CRISPR-Cas系统
doi:10.1016/j.cell.2016.11.053


来自中科院生物物理所,美国Sloan研究所的研究人员发表了题为“PAM-Dependent Target DNA Recognition and Cleavage by C2c1 CRISPR-Cas Endonuclease”的文章,介绍了近年来新发现的CRISPR-Cas系统:CRISPR-C2c1,他们解析了C2c1-sgRNA二元复合物及C2c1-sgRNA-DNA多种三元复合物结构,并明确了C2c1对双链DNA的切割会产生7nt的粘性末端,这是目前所有用于基因组编辑的CRISPR-Cas系统所能产生的最长粘性末端。

这一研究成果公布在12月15日的Cell杂志上,研究人员包括中科院生物物理所国家“青年千人计划”高璞研究员。

在最新这项研究中,高璞课题组与Patel教授等人首先解析了C2c1-sgRNA二元复合物及C2c1-sgRNA-DNA多种三元复合物结构。并且他们通过结构分析,揭示了C2c1不同于Cas9和Cpf1的独特靶DNA识别和切割方式。

同时在之后的生化实验中,研究人员首次明确了C2c1对双链DNA的切割会产生7nt的粘性末端。这是目前所有用于基因组编辑的CRISPR-Cas系统所能产生的最长粘性末端,将有希望提高切割后的连接效率。

11. Science:张峰等人发现CRISPR在非编码基因组中的应用
doi:10.1126/science.aag2445
两个独立的研究小组分别证明了基于CRISPR的技术可以用于识别疾病相关基因的关键调控元件。

来自麻省理工学院,Broad研究院等处的研究人员利用一个大型单导向RNA(sgRNA)文库,发现了影响癌症患者耐药性的基因的非编码调控元件,这一重要的发现公布在9月29日的Science杂志上,同期杂志的另外一项独立研究采用了一种高通量CRISPRi筛选技术,也在距离两种疾病相关基因1Mb(兆碱基)处发现了非编码元件。

在第一项研究中,Broad研究院的张锋研究组采用18,000 sgRNAs文库在三个基因(CUL3,NF1 和NF2)周围100个碱基范围内完成了一项715个碱基的CRISPR/Cas9筛选。从中他们发现一些非编码位点,这些位点如果发生突变,就会导致其中一个基因表达量降低。

这个研究组采用的方法并不是合成单个的sgRNAs,而是将个体RNAs打印在类似杂交研究中的固体芯片上,然后切开RNAs,克隆进慢病毒载体中。

研究人员在每个携带BRAT基因突变的人黑色素瘤细胞中转入一个sgRNA,然后分别在对照组和vemurafenib组培养基中培养细胞。利用深度测序寻找药物组细胞中富集的CRISPR突变基因位点,结果他们找到了上百个突变位点,大多数集中在靶标基因的5’末端,这些突变会降低基因表达,此外研究人员还发现CUL3周围25个位点中有24个会导致基因转录减少,和vemurafenib耐药性。

与张锋研究组不同,在第二项研究中,Lander等人利用的是一个称为KRAB结构域的蛋白片段与Cas9融合的休眠形式,来沉默他们的靶标。在这上百个调控元件中,研究人员仅仅只发现了两个调控GATA1基因的增强子元件,和七个调控MYC表达的增强子元件。

这两个研究组也得到了芯片技术的验证(染色质分析,三维构象捕获,转录因子分析),说明了利用CRISPR工具追踪非编码调控网络的可能性。Lander研究组发现并标记了MYC和GATA1增强子区域,张锋研究组在CUL3周围发现了众多增强子和转录因子结合位点。

12. Nature:重磅!发现两种新的CRISPR系统
doi:10.1038/nature21059
(本篇平台做过详细解读,点击查看)


在一项新的研究中,来自美国加州大学伯克利分校的研究人员在之前未被探究过的很难在实验室里培养的细菌中发现简单的类似于CRISPR-Cas9—一种已引发生物学变革的基因编辑工具—的CRISPR系统。

这些新的CRISPR系统是高度紧凑的,适合于在地球上的一些最小的生物体内存在。如果这些系统也能够像CRISPR-Cas9那样接受改造,那么它们较小的尺寸使得它们更容易插入到细胞中进行DNA编辑,从而扩大科学家们和医生们能够获得的基因编辑工具箱。

在这些新的CRISPR蛋白中,一种被称作CasY的蛋白是在一群庞大的最近被认识到的细菌—Banfield将之称为候选门辐射群(candidate phyla radiation, CPR),可能含有一半的细菌多样性,生活在间歇喷泉和地下几英尺的土壤中—中发现的。另一种新的蛋白被称作CasX,是在来自已知的生活在地下水和沉积物中的细菌门的细菌中发现的。

研究人员随后在大肠杆菌中重建CasX和CasY系统,并且发现这些系统让这种细菌—正常情形下不含有一种有活性的CRISPR系统—阻止外源DNA转化。Doudna和她的同事们正在研究这两种系统在生化上如何工作,以便希望构建出一种可作为CRISPR-Cas9补充的基因编辑工具。

13. Cell:首次发现CRISPR/Cas9基因编辑的“关闭开关”
doi:10.1016/j.cell.2016.11.017
CRISPR/Cas9基因组编辑正快速地引发生物医学研究变革,但是这种新技术迄今为止并不是非常精确的。这种技术能够在基因组中无意地产生过多的或者不想要的变化,产生脱靶突变,从而限制了它在治疗应用中的安全性和疗效。

如今,在一项新的研究中,来自美国马萨诸塞大学医学院和加拿大多伦多大学的研究人员发现首批已知的CRISPR/Cas9活性“关闭开关”,从而为CRISPR/Cas9编辑提供更好的控制。

马萨诸塞大学医学院RNA治疗研究所教授Erik J. Sontheimer博士、多伦多大学分子遗传学教授Alan Davidson博士和多伦多大学生物化学助理教授Karen Maxwell博士鉴定出三种自然产生的抑制Cas9核酸酶的蛋白。这些被称作抗CRISPR的蛋白具有阻断Cas9切割DNA的能力。

14. Cell:赞!又发现两种新的抗CRISPR蛋白
doi:10.1016/j.cell.2016.12.009


在刚刚发现几种能够阻断人细胞中的CRISPR-Cas9活性的蛋白(Cell, doi:10.1016/j.cell.2016.11.017)之后,来自美国加州大学旧金山分校的Joseph Bondy-Denomy和同事们在一项新的研究中报道了更多的抗CRISPR蛋白(anti-CRISPR)。

研究人员先假设细菌基因组可能含有一种抑制剂来阻止CRISPR切割其自身基因组中的靶标,然后通过在细菌基因组中寻找CRISPR序列和它的靶标而发现这些Cas9抑制剂。确实,Rauch和同事们揭示出几种存在于李斯特菌中的抗CRISPR蛋白,而且这些抗CRISPR蛋白的序列是之前的噬菌体感染中遗留在李斯特菌基因组中的。Rauch说,“正如CRISPR技术是基于细菌的天然抗病毒防御系统开发出来的,我们也能够利用病毒制造出的抗CRISPR蛋白来绕过这些细菌防御系统。”

这项研究发现两种蛋白抑制剂AcrIIA2和AcrIIA4阻断来自酿脓链球菌的Cas9酶活性,其中Cas9是一种经常用于基因组编辑中的DNA切割酶。

15. CRISPR之父张锋2017年开年综述
doi:10.1002/bies.201600186

近期Broad研究员的CRISPR技术先锋张锋,与美国国立健康研究院Eugene V. Koonin研究员合作发表了一篇综述:Coupling immunity and programmed cell suicide in prokaryotes: Life-or-death choices。在文中他们指出,CRISPR-Cas的盛行主要是因为其在基因组编辑与调控中可以作为新一代的研究工具,但是CRISPR-Cas系统本身也令人着迷,尤其是作为一种独特的免疫系统机制,可以说,CRISPR-Cas功能中最绚烂的部分就是它是唯一一种已知的,携带可遗传基因组记忆的获得性免疫系统,即拉马克理论中获得性性状遗传机制。

同时CRISPR-Cas系统的发现也刺激了原核生物防御系统的研究,在这个过程中,免疫力与程序性死亡之间千丝万缕的关系变得更为明确了,从而这两种防御系统之间的功能偶联关系理论也逐渐形成。这篇综述就主要探讨了这两者之间的关联,并从目前的研究发现出发,介绍了一些防御系统,免疫力与程序性死亡的有限融合。

目前CRISPR-Cas系统可分为两个不同的种类,每种包含三大类型和多个亚型。结合生物化学与分子遗传学大大推动了揭示不同CRISPR-Cas类型许多独特的特征。此外,结构分析和单分子研究进一步增进了我们对CRISPR-Cas功能分子基础的认识。但是我们对CRISPR-Cas系统的认识还有许多问题有待揭示,比如对于近期发现并确定了新CRISPR-Cas类型的特征表明,以我们当前的知识来预测亲缘关系遥远的CRISPR-Cas变体的功能细节能力还相对有限。因此,需要彻底地剖析新发现的CRISPR-Cas系统认识它们的生物学作用,揭示它们的分子机制,利用它们的潜能来开发生物技术。

16. CRISPR女神Jennifer再发重量级Reviews:CRISPR-Cas系统引领药物发现途径和疾病治疗方案的革新
doi:10.1038/nrd.2016.238


CRISPR-Cas系统作为基因组编辑和调节的编程工具,可以在各种细胞中(包括人类细胞)进行遗传操作。虽然目前科学家们的注意力主要集中在CRISPR-Cas系统治疗孟德尔遗传疾病方面的潜力,但是该技术还有望为复杂的体细胞疾病提供新的治疗方法,同时CRISPR-Cas通过加速药物靶点的鉴定和验证,成为下一代药物研发的有利工具。

近日CRISPR先驱——“女神”Jennifer在nature再发新成果,她的研究小组发现了两个CRISPR新系统,十分振奋人心。由此可见CRISPR自问世以来总是带给人们惊喜不断,可谓引发了遗传学等生物学科研究和医药领域的革命。12月23日《Nature Reviews Drug Discovery》在线发表的文章,Jennifer也参与其中,此次她们将目光投向CRISPR-Cas系统带来的药物发现途径和疾病治疗方案的革新。

CRISPR-Cas编辑可以加速功能基因组学发展,揭示细胞机制并确证新的药物靶点,开发更好的用安全性测试的模型,以及改善治疗方案等。快速基因编辑也可以生成定制的自体细胞治疗,包括癌症治疗的T细胞和重新编程的ipsC,应用于非遗传性疾病创新疗法。虽然CRISPR-Cas系统将进一步改进,但我们相信基因编辑已开始对全世界的药物发现和开发产生直接的影响。

17. 中科院生物物理研究所王艳丽课题组在Crispr/Cas系统获得新的研究成果
doi:10.1016/j.molcel.2016.11.040

2016年12月15日,Molecular Cell 杂志在线发表了中科院生物物理研究所王艳丽课题组关于CRISPR-Cas系统的最新研究成果,文章标题为“C2c1-sgRNA Complex Structure Reveals RNA- Guided DNA Cleavage Mechanism”。

在本研究中,课题组成员解析了结合有sgRNA的C2c1晶体结构。该结构显示C2c1由两个区域构成,分别是具有识别sgRNA功能的REC区域和具有核酸酶功能的NUC区域。sgRNA是由crRNA和tracrRNA人工嵌合而成,其中,crRNA结合在C2c1的中心孔道内,tracrRNA则被安置在C2c1外表面的凹槽中。有趣的是,通过进一步观察,课题组研究人员发现C2c1对应的sgRNA呈现出一种与Cas9对应的sgRNA或最近报道过的Cpf1所对应的crRNA显着不同的结构。受到这个新结构的提示,研究人员一方面分析了其他物种的C2c1所对应的sgRNA结构,另一方面缩短了该sgRNA的长度,并进行活性实验,这两方面的结果都初步验证了这种独特结构的真实性和有效性。此外,该研究还发现目的序列的单个碱基突变可以显着降低C2c1剪切活性,这表明C2c1对靶定的目的序列有极其严格的要求,这一研究结果有助于开发新的基因组编辑工具,降低基因编辑过程中的脱靶现象。

18. Nat Genet:利用CRISPR鉴定出潜在的HIV治疗靶标
doi:10.1038/ng.3741

在一项新的研究中,来自美国怀特海德研究所、拉根研究所和布罗德研究所的研究人员利用CRISPR-Cas9基因编辑技术鉴定出三个有望用于治疗HIV感染的新靶标。他们描述了如何利用CRISPR筛选HIV感染但不是细胞存活所必需的人基因的方法鉴定出5个基因—它们的三个在早前的利用RNA干扰(RNAi)的研究中并未被鉴定出。他们的方法也能够被用来鉴定出针对其他的病毒性病原体的治疗性靶标。

利用CRISPR对源自HIV敏感性的CD4阳性T细胞的一种细胞系进行筛选,研究人员鉴定出5个基因:当让它们失活时,会让细胞免受HIV感染,同时不会影响细胞存活。除了CD4和CCR5之外,这种筛选方法鉴定出编码两种酶的基因—TPST2和SLC35B2:它们对CCR5进行修饰以便HIV结合。另一个被鉴定出的基因是ALCAM,它参与细胞间粘附。当CD4阳性T细胞接触低水平HIV病毒时,正如在自然传播中可能观察到的那样,ALCAM缺失与显著地抵抗HIV感染相关联。

19. Science:重磅!利用CRISPRi鉴定出细胞生长所需的499个lncRNA
doi:10.1126/science.aah7111

长链非编码RNA(lncRNA)是一类神秘的长200多个核苷酸但不会编码任何蛋白的分子。如今,在一项新的研究中,研究人员鉴定出499个lncRNA是功能性的,并且在理解这些分子如何发挥作用方面取得重大进展。他们报道,不同于大多数蛋白编码基因—它们往往是众多细胞系所必需的—的是,针对测试的6种细胞系,在鉴定出的lncRNA中,将近90%的lncRNA似乎影响仅仅其中的一种细胞系的强劲生长。

Lim、Weissman和同事们开发出一种CRISPR干扰(CRISPR interference, CRISPRi)平台,这种平台靶向7种不同的细胞系—6种转化的细胞系和一种人诱导性多能干细胞—中的16,401个lncRNA位点。通过利用他们的这种经过修饰的CRISPR技术抑制每个候选lncRNA的表达从而对上千个位点进行筛选之后,他们鉴定出499个lncRNA位点是强劲的细胞生长所需要的,其中89%的位点似乎仅在一种细胞类型中发挥功能。

Rinn说,“这项研究是首次在特定的细胞系中对lncRNA进行全基因组筛选。依据这项研究,我们如今能够作出结论:大多数lncRNA在细胞活力中发挥着重要作用,正如猜测中的那样。但是如今,可以这么说,一切还得实践证明。”

20. Nat Methods:开发出自我编辑的CRISPR条形码
doi:10.1038/nmeth.4108


通过调整CRISPR-Cas9基因编辑复合体,使得它在自己的向导RNA(gRNA)位点上发生突变,研究人员开发出一种方法让细胞持续地产生它们自己独特的条形码。根据上周(12月5日)发表在Nature Methods期刊上的一篇论文,这种技术是由美国麻省理工学院和哈佛大学的两个研究团队独立开发的,已在哺乳动物细胞中用于分子记录—正如今年夏天(8月18日)在Science期刊(doi:10.1126/science.aag0511)上描述的那样—和用于谱系追踪。

当利用CRISPR-Cas9系统在真核细胞中产生突变时,可能存在的突变数量受到gRNA本身的限制。在靶DNA元件发生一些突变后,gRNA不再具有足够的序列同源性,因而不能够有效地引导Cas9。

为了增加CRISPR-Cas9系统的信息储存能力,两个研究团队—一个团队由麻省理工学院科学家Tim Lu领导,另一个团队由哈佛大学科学家George Church领导—想出同一种解决方法:让gRNA位点含有一种PAM序列以便能够自我编辑。

Lu团队利用它的“自我靶向”CRISPR系统构建出记录炎症的细胞:这些细胞在对小鼠体内的炎性信号作出反应时,会启动gRNA位点发生自我引导的突变。与此同时,Church团队利用它的“自导(homing)”系统追踪体外培养的细胞谱系。

Church实验室研究员Reza Kalhor说,这种自导gRNA系统“在它的位点上产生的多样性是常规的gRNA在它的靶标上的8到10倍。”然而,这种记录能力并不是无止境的。他解释道,“[CRISPR产生的]大量突变往往是缺失突变”,因此在一系列突变后,这种匹配的RNA序列—开始时仅20个核苷酸左右—变得太短而不能发挥功能。Kalhor说,“它基本上是搬起石头砸自己的脚。”

21. Cell:将CRISPR和单细胞RNA测序结合在一起分析基因功能
doi:10.1016/j.cell.2016.11.039
哪些突变组合有助癌细胞存活?大脑中哪些细胞参与阿尔茨海默病发生?免疫细胞如何执行它们的复杂决策过程?如今,在一项新的研究中,来自以色列魏兹曼科学研究所等机构的研究人员在一种方法中将两种强大的研究工具—CRISPR基因编辑和单细胞基因组分析—结合在一起,从而可能最终有助我们解答这些问题和更多的其他问题。

将CRISPR与高分辨率的单细胞RNA测序结合在一起能够让研究人员主动地调整细胞中的基因,然后理解它们在多种条件下在多种细胞中的功能。Amit和他的团队(包括论文第一作者Diego Adhemar Jaitin、Ido Yofe和Assaf Weiner,研究生David Lara-Astiaso)面临的挑战是改编CRISPR基因编辑技术以便它能够与单细胞测序结合在一起使用。Amit团队想象着一次靶向多种基因,包括靶向同一个细胞中的多个靶标,然后鉴定出给细胞带来的变化和这些基因的功能。一方面,这项任务需要开发新的分子技术以便同时鉴定出靶细胞和引入到它们当中的基因组编辑。另一方面,这项任务需要开发新的计算方法来分析具有不同基因型和表型的细胞群体。

研究人员随后遇到一种新的数据类型—伴随着一些遗失的数值。Weiner说,“通过将细胞与类似的行为关联在一起,Netflix算法等被用来将喜欢类似电影的人们进行归类,我们能够鉴定出很多基因之前未被分类的功能。”

22. 中国科学家研究发现肿瘤恶病质的潜在基因治疗方法
doi:10.1038/mt.2016.172


12月5日,国际学术期刊Molecular Therapy发表了我所丁秋蓉研究组的最新研究成果“Prevention of Muscle Wasting by CRISPR/Cas9- mediated Disruption of Myostatin In Vivo”。该研究针对肿瘤病人中存在的严重肌肉萎缩病症,提出通过CRISPR在体特异靶向敲除肌肉组织中的肌生成抑制素(myostatin)达到延缓肌肉萎缩的治疗目的。

在此项研究中,研究生韦余达等在丁秋蓉研究员的指导下通过SaCRISPR/Cas9针对在恶病质中被激活进而诱导肌肉蛋白降解的myostatin信号通路,通过在体靶向敲除肌肉中的myostatin达到了部分缓解恶病质的效果。选择myostatin作为靶点的主要原因为:1)myostatin信号通路为肌肉生长发育的负调控因素。已发现天然携带myostatin功能缺失突变的自然人,除肌肉系统强壮外,临床上没有发现其他严重不良影响,靶向安全性有所保证;2)前期的系列小鼠和临床试验证明myostatin信号通路在恶病质中起关键作用,而针对myostatin的单抗目前正处在临床试验期(针对胰腺癌病人的恶病质治疗);3)myostatin主要由肌肉细胞分泌,主要作用方式是自分泌/旁分泌方式,因此局部肌肉微环境中的myostatin浓度降低便能在恶病质发生情形下保留部分肌肉功能。

基于此,韦余达等利用肌肉特异启动子启动SaCas9(staphylococcus aureus cas9)的表达,包装入腺相关病毒载体(AAV)后,通过定点注射小鼠腓肠肌组织靶向小鼠Mstn基因(编码myostatin蛋白),在肿瘤诱导的恶病质小鼠模型中观察到骨骼肌功能的显著恢复(相比未靶向组小鼠,平均骨骼肌重量提高9%,平均抓力提高25%,并且在注射点处切片染色发现肌纤维萎缩得到明显缓解)。研究作为一个验证性实验,提示利用基因编辑特异靶向敲除肌肉组织中的myostatin可以作为防治恶病质的一个潜在基因疗法,而进一步提高体内靶向效率、全面评估靶向安全性将有助于其真正的临床转化。

23.PNAS:重磅!利用分子乐高产生更优的CRISPR基因编辑工具
doi:10.1073/pnas.1616343114

在一项新的研究中,来自加拿大西安大略大学的研究人员利用分子乐高(molecular-Lego),将一种工程酶加入到革命性的新的基因编辑工具CRISPR/Cas9中。他们的研究表明在靶向基因组中的基因中,加入这种酶会使得基因编辑更加高效和潜在地更具特异性。

研究人员证实构建一种被称作TevCas9的酶会使得DNA修复更难再生这个切割位点,其中TevCas9是在两个位点而不是在单个位点切割DNA。他们是通过将一种被称作I-Tevl的酶加入到核酸酶Cas9上而构建出TevCas9的。在基因编辑工具CRISPR/Cas9中,Cas9是一种典型的用于切割DNA的酶。

这项研究也表明加入I-Tevl有望更加特异性地靶向基因,而且更不可能在基因组上产生脱靶效应,其中脱靶效应是任何潜在治疗应用的一个重大的问题。(本文来源于生物谷)


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