生信分析、meta分析、数据挖掘
TCGA、GEO、SEER、Oncomine

DJ-1通过调控破骨细胞分化调节骨稳态 | 文献精读

精彩不容错过,点击科研小助手↑↑↑免费订阅

背景
骨稳态的维持依赖于成骨细胞和破骨细胞之间功能的协调。异常增强的骨吸收可致骨质疏松、Paget’s病、RA等骨相关疾病。有功能的破骨细胞的生成需要MCSF和RANKL的协同刺激。MCSF可维持破骨前体细胞的生存和增殖,RANKL促进破骨细胞生成。RANKL和其受体RANK结合后,募集TRAF6,激活MAPK、NF-κB、JNK、AP-1等多条信号通路促进破骨细胞生成。另外,RANKL诱导破骨生成也需要激活DAP12和FcRγ的ITAMs,以产生Ca+信号。TRAF和ITAMs介导的信号协调作用,上调破骨分化的主要转录因子NFATc1表达。


活性氧(ROS)(包括H2O2、超氧阴离子等)作为受体介导信号传递中第二信使的作用在较多种细胞中都有报道。在RNAKL诱导破骨分化过程中有ROS的产生,ROS反过来可以进一步增强RANKL的作用,进一步促进破骨细胞形成和骨吸收。因此ROS水平的精细调节对于骨稳态的维持至关重要。


DJ-1(PARK7作为ROS清除蛋白除了本身可以起作用外,还可以增强超氧化物歧化酶、过氧化氢酶清除ROS的能力。DJ-1的功能的丧失可致Parkinson’s病、高血压、过敏、肥胖等。而DJ-1在破骨生成中的作用尚未报道,作者就此进行了研究。


——正文解读——


首先作者构建了DJ-1敲基因小鼠(全敲),于10周龄行股骨远端骨量测定。可见DJ-1-/-雄性小鼠相对WT骨量下降,股骨远端皮质骨厚度降低,面积减小(Fig 1a)。骨相关指标BV/TV、Tb.Th、Tb.No、Tb.Sp、Ct.area、Ct.Th指标均有统计学意义的变化(Fig 1b)。 


其TRAP染色(Fig 1e)也可看到DJ-1-/-1-雄性小鼠相对WT而言,破骨细胞数量增多,而且可看到骨表面成骨细胞也有所增加(Fig 1f)。 


但是作者发现体外实验中,DJ-1-/-会轻度抑制成骨分化,成骨标记碱性磷酸酶和骨钙素mRNA表达水平降低,茜素红染色也有轻度降低(Sup Fig4)。


可能体内成骨细胞的增加是骨丢失后的负反馈机制, DJ-1-/-小鼠血清骨吸收标记物CTx相对WT升高(Fig 1g  未说雌雄)。而DJ-1-/-雌性小鼠相对WT雌性小鼠的骨量等未见明显差异(有可能是雌雄小鼠达骨峰值的周数差异)。 


接着作者研究DJ-1对破骨细胞生成的影响,使用了人CD14+单核细胞和小鼠BMMs两种细胞,作者首先检测了DJ-1-/-对RANK表达影响,发现DJ-1-/-并不影响RANK的表达(Sup Fig 1)。沉默DJ-1后,可见相对control而言,siDJ-1组破骨细胞数量增加(Fig 2a)。DJ-1的沉默也使NFATc1的表达上调(Fig 2b)。


DJ-1-/-敲除BMMs在MCSF和RANKL的刺激下,破骨细胞数量增多,肌动蛋白带增大(此处作者称actin belt ,而非actin rings.玻片上染出来的称作actin belt,只有骨片上有骨吸收功能的才可称作actin rings),TRAP活性增加(Fig 2c,d)培养基中CTx量也升高(Sup Fig 2)。


骨吸收实验中可见DJ-1-/-BMMs组吸收面积增加,但单个破骨细胞的骨吸收pit area并无明显变化。另成熟破骨细胞(mature OC, BMMs用30ng/ml MCSF 和100ng/mlRANKL处理3天得到)骨吸收能力相比对照无可见变化(Fig 2e f),DJ-1仅影响破骨分化,而对成熟破骨细胞的功能无明显影响。


DJ-1-/-BMM在分化过程中也可见到与破骨细胞生成相关蛋白NFATc1、TRAF6、CTSK、c-Fos、c-Src表达的上调(Fig 2g)。DJ-1-/-BMMs过表达DJ-1后,可见破骨细胞生成数量减少,TRAP活性降低(Fig 2h)DJ-1敲除对破骨分化的影响并不是通过影响BMMs增殖或者凋亡实现的(Fig 2i j)。


接下来,作者思考DJ-1是通过调节哪条通路来影响破骨分化的。通过对WB发现,DJ-1的缺失致使MAPKs(JNK ERK p38)Akt、IkBα和ITAM介导通路激活均有增加(Fig 3a b)。Syk活性增加(Fig3 c)。


为了进一步验证这些通路的激活程度的改变是由DJ-1敲除造成的,作者于DJ-1-/1 BMMs中转入DJ-1质粒,可见到上述激活程度的下调(Fig 3d)。说明DJ-1负向调控相TRAF6和ITAM介导通路。进一步的实验发现,在RANKL刺激下,DJ-1-/- BMMs相比WT,早期TRAF6和RANK、FcRγ和Syk的结合增加(Fig 3 ef)。  


DJ-1作为ROS清除蛋白,其对RANKL刺激信号通路的影响是否是通过ROS起作用呢?在DJ-1-/-组加入ROS清除剂TEMPO后,RANKL的对下游通路的激活下调(Fig 4a)。破骨分化过程中,ROS产生增加,DJ-1-/-组在RANKL作用下也有更多的ROS产生(Fig 4bc)。


人CD14+单核细胞沉默DJ-1后得到同样的结果(Fig 4f)。


DJ-1质粒转入DJ-1-/-BMMs或者加入ROS清除剂TEMPO后,在RANKL作用下,ROS产生减少(Fig 4de)。先前也有报道在破骨分化过程中ROS刺激RANKL介导信号的激活,作者发现H2O2可以激活TRAF6和ITAM介导的信号通路(Fig 4gh),且在DJ-1敲除组中加入H2O2后,激活进一步增强。TEMPO也可以抑制破骨分化(Fig 4ij)。可见DJ-1对破骨分化的影响是通过ROS对TRAF6和ITAM介导信号的调节实现的。


SHP-1作为PTP(protein tyrosine phosphatase)家族成员之一,也称酪氨酸蛋白磷酸酶非受体型6,有报道其可同时抑制破骨分化过程中TRAF6和ITAM介导信号通路,而ROS又可抑制SHP-1的活性。在破骨分化过程中,DJ-1是通过SHP-1实现对TRAF6和ITAM介导信号的调节吗?首先在DJ-1-/-BMMs组在RANKL刺激下相对WT而言,SHP-1磷酸化明显降低(Fig 5a),磷酸酶活性下降(Fig 5b),在H2O2和RANKL作用下,SHP-1磷酸酶活性也会降低(Fig 5c)。说明DJ-1通过ROS的调节进一步调节SHP-1,接下来就是验证SHP-1和TRAF与ITAM的作用。


Fig 5d可以看到DJ-1-/-组SHP-1和TRAF的结合减少,通过添加H2O2得到了同样的结果(Fig 5 fg,f和g图互相验证)。


Fig 5e可以看到DJ-1-/-组SHP-1和FcRγ的结合减少,通过添加H2O2得到了同样的结果(Fig 5 hi, h和i图互相验证)。 以上说明在破骨分化过程中,DJ-1是通过SHP-1来调节TRAF和ITAM介导的信号。

接下来,作者做了两个动物模型,
7周大雄性DJ-1-/-小鼠和对照,颅骨注射1mg/kg RANKL,连续注射5天,然后ROS活性测定,可以看到注射RANKL后ROS产生增加,而DJ-1-/-组有更多的ROS产生(Fig 6 a b)。颅骨TRAP染色,可以看到DJ-1-/-组也有更多的破骨细胞生成(Fig 6 cde)。


可见DJ-1敲除可以增加体内ROS量,并促进破骨细胞生成。DJ-1确实也会增加LPS诱导骨溶解模型中ROS量,和破骨细胞量(Sup Fig3)。


在胶原诱导关节炎模型(CIA)中,可看到血清H2O2活性氧增加(Fig 7a)。可以看到,在DJ-1-/-组小鼠,关节肿胀更加严重,评分增高,累计发病率增加(0分 正常;1分 红斑或稍肿胀;2分 红斑且轻度肿胀并从踝关节至跖趾关节;3分 红斑且中度肿胀;4分 红斑且踝、足趾重度肿胀。大于等于1分确定为关节炎)(Fig 7bcd)。


踝关节HE染色,可以看到DJ-1-/-组小鼠关节软骨破坏更为严重,关节腔狭窄。TRAP染色也可看到更过的破骨细胞(Fig 7efg),但是因为小鼠爪子肿胀很严重,说明炎症也很重,所以破骨细胞数量的增加有可能不仅仅是DJ-1敲除的作用。


Fig 7f为形态学评分(0分 正常;1分 很少关节软骨面破坏及验证细胞浸润;2分 轻度滑膜层增生及关节软骨破坏;3分 中度关节软骨破坏及血管翳形成;4分 重度关节软骨破坏及骨侵蚀;5分 重度炎症细胞浸润,骨侵蚀,关节软骨破坏)。DJ-1-/-组小鼠踝部关节组织也有更高水平的破骨细胞标记蛋白表达(Fig 7hi)。可见DJ-1的敲除,可加剧胶原诱导关节炎的骨溶解。(不全是破骨细胞的作用,毕竟是全敲,炎症细胞的作用很大) 


Fig 8 是本文的DJ-1调节破骨细胞生成的机制图。RANKL诱导破骨细胞生成过程中有ROS产生,ROS 可进一步促进破骨细胞形成。DJ-1作为ROS清除蛋白,调节破骨细胞分化,从而对骨稳态进行调节。ROS通过SHP-1调节RANK下游TRAF6和ITAM,影响破骨细胞分化,DJ-1对破骨分化的调节也就经由这两条通路进行。


总结
DJ-1敲除雄性小鼠,骨量减少,破骨细胞数量增多。作者就此探讨DJ-1影响破骨细胞生成的可能机制。首先发现DJ-1敲除影响RANK下游TRAF6和ITAMs,然后证明了DJ-1敲除后ROS表达量上升,另外有报道SHP-1可同时抑制破骨分化过程中TRAF6和ITAM介导信号通路,而ROS又可抑制SHP-1的活性,由此发现DJ-1是通过SHP-1调节TRAF6和ITAMs信号通路。最后做了动物模型。由于小鼠是全敲,所以动物表型结果不应全归为DJ-1敲出后破骨细胞增加的结果。

补充
文中的pY为酪氨酸磷酸化的意思。


参考文献(公众号内回复“JC65”下载原文)

1 Kim HS, Nam ST, Mun SH et al. DJ-1 controls bone homeostasis through the regulation of osteoclast differentiation. Nature Communications 2017; 8.


各位读者:

科研小助手官方QQ群:93646661
添加微信号amateur_1988为好友,加入科研小助手官方微信群。申请加好友请备注姓名和单位。
↓↓↓点击阅读原文查看往期精彩!

赞(0) 打赏
未经允许不得转载:医学SCI科研之家 » DJ-1通过调控破骨细胞分化调节骨稳态 | 文献精读
分享到: 更多 (0)

评论 抢沙发

  • 昵称 (必填)
  • 邮箱 (必填)
  • 网址

meta分析、生信分析

meta、生信交流群综合科研交流群