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雄激素可以通过IL-6促进局部SOCS3活性对骨皮质形成的调控 | 文献精读

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背景

长骨干骺端骨皮质的形态影响长骨的骨强度,其主要由松质骨在干骺端联合而生成。目前,干骺端骨皮质生成的机制尚不明确,既往文献曾指出在不表达IL-6的小鼠中骨皮质强度、骨膜生长均受到明显抑制。在成骨细胞、骨细胞中敲除gp130(一种IL-6受体的组成成分)后可导致皮质骨质量下降、骨宽度增加,提示IL-6家族在维持皮质骨质量方面起着重要作用。作者在前期工作中发现小鼠抑瘤素M(OSM,IL-6家族的一种蛋白)刺激后细胞内STAT3信号通路激活,从而可激活 gp130信号通路改善骨量减少的程度。细胞因子信号抑制物SOCS3可抑制STAT3信号通路及其下游靶基因的表达,作者在此项研究中拟特异性敲除SOCS3来观察其对骨皮质形成的影响。


——–正文解读——–


Fig1

首先,作者通过构建Dmp1Cre.Socs3f/f小鼠(在表达Dmp1的细胞中特异性敲除Socs3,主要为骨细胞、成骨细胞、软骨细胞)来观察对骨发育的影响。图a示和对照组相比,敲除组股骨Socs3 mRNA表达显著下降,雌性小鼠更明显。(注:基因敲除后残余的Socs3表达主要是由非骨细胞系的细胞所产生)

在2周龄时,Socs3敲除组股骨BV/TV及骨小梁数目大于对照组,而股骨长度两个无明显差异。


在6周龄时,Socs3敲除组股骨BV/TV、骨小梁数目及厚度均高于对照组。

值得注意的是,在第12周,股表型显示出明显的性别差异。在雄性小鼠中,原本在6周敲除组表现出的高骨量在12周变为较对照组骨量降低,BV/TV、骨小梁数量明显低于对照组,骨小梁分离度明显升高,这一情况一直持续到26周。而雌性小鼠敲除组股骨BV/TV、骨小梁数目及厚度仍高于对照组,但骨小梁的排列较为混乱。

在第26周,雌性敲除组骨小梁也出现明显减少,并且皮质骨表现出多孔性。


Fig2


随后,作者首先围绕6周时敲除组在雌性和雄性均表现出明显增多的骨小梁是因为成骨能力增强还是破骨能力减弱展开研究。


组织形态学显示敲除组中成骨细胞面积和类骨质面积均高于对照组,同时钙黄绿素荧光染色也证实敲除组的骨小梁增多主要是由于成骨能力的增强。


在对照组的钙黄绿素荧光染色中,正常的骨小梁为明显的两条线样结构,而敲除组中可见新生骨为分散状非线样结构的编织骨。


敲除组成骨能力增强的同时,破骨细胞面积与对照组相比无明显差异。


番红O染色(染软骨)也显示在敲除组的骨小梁之间无明显残余的软骨且生长板无明显延长,提示敲除组的骨吸收能力未受到明显抑制


总结:图2说明敲除组在6周时出现的骨表型变化主要是由于成骨能力增强所致

Fig3

接着作者进一步探究在12周出现的因性别不同导致敲除组的骨表型差异的原因。

尽管雌性和雄性敲除组的成骨细胞面积、类骨质面积仍显著高于对照组,但是与6周不同之处在于雄性敲除组股骨中破骨细胞面积明显高于对照组。
 


对于雌性敲除组,图d,e,f均得出与6周龄相同的结论,即松质骨的增多主要是由于成骨能力增强所致(以不成熟的编织骨为主)。

26周龄时检测血清相关骨代谢指标,显示相较于对照组,敲除组的骨形成和骨吸收均明显增强,此结果恰好与前述26周敲除组骨小梁分离度增加向对应。


Fig4


作者随后使用micro-CT扫描26周雌雄小鼠股骨,发现雌雄小鼠在股骨干皮质骨中敲除组骨皮质形成存在明显缺陷(星号处为矿化不足处)。


通过统计分析及3点折弯实验,显示敲除组与对照组在皮质骨面积、所受最大应力
方面无明显差异。但在雌性小鼠中,3点折弯结果显示敲除组衰竭功和形变均明显小于对照组,提示雌性小鼠骨皮质形成受损。


同时对比图1中3D重建图,可发现12周时雌性小鼠骨小梁与骨皮质界限不清,提示骨皮质形成受抑制。


Fig5


根据上述敲除组和对照组小鼠不同年龄和性别间的差异,作者构建了去性腺小鼠模型。在第6周摘除敲除组和对照组雌性小鼠的性腺,后分为未处理组、雌二醇组、双氢睾酮组,于12周处死(处死前注射钙黄绿素)


对于雌性小鼠而言,敲除组椎体骨量明显低于对照组,而前述股骨表型为敲除组高于对照组(为何会有这种差别?)。作者解释为晚期骨皮质形成主要为四肢骨较厚的骨皮质形成而非椎体部较薄的骨皮质形成。

雄性小鼠敲除组椎体骨量同样明显低于对照组。而使用雌二醇和双氢睾酮后,均能减缓雌雄小鼠去势手术后的骨量减少。


Fig 6


对于雌性对照组小鼠股骨来说,去卵巢能明显降低骨量,同时雌二醇和双氢睾酮能缓解骨量的丢失


雌性敲除组小鼠股骨中,可观察到Socs3基因敲除后骨皮质与骨松质的界限不清,去卵巢后可增强骨皮质的形成(尽管生成的骨皮质存在多孔性),这一作用可被雌二醇抑制

雄性小鼠股骨中,可观察到敲除组和对照组去除性腺后股骨骨量均明显减少,这一过程可被双氢睾酮抑制。在Socs3敲除组经雌二醇治疗后骨小梁杂乱无章,与骨皮质界限不清,而未敲除组中未出现此情况。提示雌二醇可通过SOCS3相关途径抑制骨皮质形成。

随后作者统计了各组小鼠股骨的骨皮质厚度和非完全皮质化的骨,发现雌性敲除组骨皮质厚度大于对照组,但敲除组中近四分之一为未完全皮质化的骨。同时去卵巢后经雄激素治疗可促使敲除组股骨皮质化,且厚度仍高于对照组。

在雄性小鼠中,敲除组皮质骨厚度大于对照组且不含未完全皮质化的骨,但是去势后经雌二醇治疗可明显增加骨皮质中未完全皮质化骨的含量。

作者统计了各组干骺端骨皮质孔隙率,发现雌性敲除组骨皮质孔隙率较对照组明显升高,同时去卵巢后行雌二醇治疗孔隙率反而增高,而双亲睾酮治疗后孔隙率明显降低。在雄性小鼠中,雌二醇能明显抑制敲除组去势后骨皮质化,导致皮质骨孔隙率明显升高,与雌性鼠的结果类似。

在靠近骨干相对成熟的皮质骨中,雌性和雄性小鼠敲除组的骨皮质孔隙率均高于各自对照组。因该部分骨皮质在去势及加激素治疗前就已成熟,双氢睾酮对敲除组无明显作用,但是雌二醇仍可明显提高骨皮质的孔隙率。


钙黄绿素染色显示双氢睾酮能使敲除组去势后杂乱无章的骨小梁重新变为线样结构,而雌二醇可加重骨小梁混乱的结构


Fig 6


作者在Socs3特异性敲除小鼠的基础上,进一步构建了Socs3、IL-6双敲小鼠。发现敲除IL-6后并不能挽救Socs3敲除组骨皮质化缺陷的表型,但是双敲组雄性小鼠的股骨皮质孔隙率不再明显低于雌性。

钙黄绿素染色也证实双敲后雄性小鼠骨皮质孔隙率增高。

Von Kossa染色(银染)显示雄性双敲组较单敲组骨皮质化受损,但没有雌性单敲小鼠这么明显

最后,作者结合上述实验结果,绘制了雄激素调控骨皮质形成的示意图

参考文献(公众号对话框内回复“JC66”下载原文):

Cho Dae-Chul, Brennan Holly J, Johnson Rachelle W et al. Bone corticalization requires local SOCS3 activity and is promoted by androgen action via interleukin-6.[J] .Nat Commun, 2017, 8(1): 806.


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