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(文章篇)S5E18: 现在做microRNA研究还能发…吗?前传

还记得前期的一篇文献“(文章篇)S5E14:一篇Cell子刊如何串起四个科研热点?”,他的主角是胶质瘤干细胞,那么我们今天再看一个关于肿瘤干细胞的研究方式,不同的是这次多了miRNA家族的参与。


The RNA Binding Protein IMP2 Preserves Glioblastoma Stem Cells by Preventing let-7 Target Gene Silencing.Cell ReportsMay 24, 2016

下载链接:http://pan.baidu.com/s/1eSBbUG6    密码:j5h5



Ivan Stamenkovic

本文作者Ivan Stamenkovic主要从事肿瘤干细胞研究。在接下来的几天,我们会分析他的另一篇发表于Cancer Cell的文章:A TARBP2-Dependent miRNA Expression Profile Underlies Cancer Stem Cell Properties and Provides Candidate Therapeutic Reagents in Ewing Sarcoma.



首先,看一下机制图。


胶质瘤干细胞能提升表达let-7的miRNA水平以及其靶基因,包括IMP2。作者发现IMP2能结合到let-7的靶向转录本的miRNA识别元件,保护其不受降解。

  • 在胶质瘤干细胞中,当LIN28B缺乏,能提升let-7miRNA水平,以及let-7miRNA的靶基因

  • 在胶质瘤干细胞中,RNA结合蛋白IMP2高表达,它是let-7靶蛋白

  • PAR-CLIP技术表明IMP2结合到let-7靶基因上,防止它们被沉默

  • IMP2或许取代了LIN28B对于肿瘤中let-7靶基因保护以及胶质瘤干细胞维持干性作用

肿瘤干细胞能促使肿瘤生长,依赖于转录后调控基因表达以及相关miRNAs介导来维持自身的干性

let-7miRNA家族能通过沉默干细胞程序增强其分化。而LIN28A/B能抑制由let-7介导的靶基因抑制作用,这能降低胚胎及一些肿瘤干细胞中let-7产生,维持干细胞干性。

作者发现GSCs缺乏LIN28,表达let-7及其靶标基因,暗示着let-7沉默的LIN28非依赖保护性。PAR-CLIP技术发现,miRNA结合蛋白2结合到let-7的miRNA识别元件,防止let-7的靶标基因沉默。


一句话:IMP2通过阻止let-7家族的靶基因沉默来维持干细胞多功能性



看主要内容太长不看版):

1、在GSC中,let-7家族及其靶向mRNAs高表达的

GSC细胞具有明显的致瘤性,而分化的该细胞则不具有致瘤性。

并且在不同态的MGG细胞中验证,发现GSC细胞中let-7家族的表达要高于分化后的细胞。因为在常见的肿瘤及胚胎干细胞中,let-7家族表达是被抑制的,这源于LNC28能妨碍let-7前体miRNA形成成熟的let-7miRNA。但是,作者发现在GSC细胞与分化细胞中(这个结果肯定是阴性的),并不存在LNC28。



作者检测了一些在GSC细胞中高表达的let-7靶基因,其中SOX2是GSC标志物。最明确的就是IMP2。


2、IMP2作为一个RBP,作者通过PAR-CLIP技术确定它GMB中的结合库

这里作者使用了一个PAR-CLIP技术,文末有段简介。

IMP2在GSC细胞中高表达,并通过CD133阳性细胞(干细胞标志物)以及在胶质瘤组织中进行验证。IMP2簇主要结合到RNA的3‘端以及蛋白编码区(CDS)。

最后作者还找到大量与IMP2结合的基因转录本库,并且发现IMP2与转录本的结合作用与这些转录本的基础表达相关。


该部分实验内容,作者并没有继续做,也许后期会有更深入的研究,拭目以待。

后面,作者通过过表达或敲除IMP2,验证了一下作用转录本的表达情况。


3、IMP2结合作用主要集中于特异性MRE上,包括let-7的靶标位点

实验表明,IMP2主要结合到附含A/T碱基序列的3'端,以及miRNA识别元件(MRE)上。

考虑到IMP2能结合到MRE上,作者认为这有可能跟AGO2蛋白有关。AGO存在于降解小体(P-bodies)中。

AGO2:成熟miRNA的功能链被Ago2装配到RNA介导沉默复合物RISCRNA诱导沉默复合体上,它引导RISC,通过mRNA剪切、转录抑制或脱腺苷化对靶mRNA进行沉默,而信使链则被分解。

通过观察IMP2以及降解小体标志物EDC2,共定位实验结果暗示着IMP2也作用于RISC.

这部分内容主要是扯进明星分子Ago2。



4、IMP2能保护由let-7诱导沉默的部分靶基因免于沉默

let-7通过MRE对靶基因沉默,作者通过前面的工作发现了,IMP2也能结合到mRNA的MRE上。通过let-7拮抗剂处理缺乏IMP2细胞,也能恢复靶标基因的表达,对该结合作用也进行了验证。

另外,IMP2敲除能增加一些靶标mRNA与Ago2的结合,而这种表达的变化源于miRNA介导的诱导沉默复合体的效应通路。



5、在GSC细胞中,LIN28B能也能恢复表达因IMP2缺失导致的靶基因沉默

首先,LIN28B表达与IMP2不相关,它们之间也无作用关系。其次,LIN28B能抑制let-7家族的表达。

LIN28B能恢复GSCs细胞成球。并且通过小鼠实验发现,只有当IMP2敲除,而且也不存在LIN28B的情况下,小鼠体内的生存期很长(体内的肿瘤不长)。




PAR-CLIP技术:

“在活体细胞中,紫外光可以将RNA与RNA结合蛋白共价结合起来。在PAR-CLIP方法中,活体细胞被暴露在紫外灯下,使得RNA-蛋白结合起来并且可以用免疫共沉淀的方法使特异性的蛋白以及与其结合RNA一同被分离出来。这个方法中最重要的一点就是方依赖了具有光活性的核糖核苷类似物,例如4-硫尿核苷,在活体细胞中将其插入到新生RNA转录本中。在356nm紫外灯辐射的细胞中,光活性的核糖核标记的RNA被诱导与RBP相互作用。免疫共沉淀所要的RBP,然后分离被交联和共沉淀的RNA。RNA随即被转换成cDNA文库并且使用Solexa技术进行深入测序。通过PAR-CLIP所准备的cDNA文库具有的一个特点就是能够准确的定位交联的位置,而这是依靠cDNA序列的突变位置。当使用4-硫尿核苷时,交联的序列将会产生T-C的转变。这种在被测序的cDNA序列中的转变提供了一个巧妙的解决准确绘制RNA结合蛋白的结合位点方法,从而从噪声中获得了真实的交联的RNA序列。”


That’s all. Thank you!



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