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细胞荧光怎么定量?快来,又发布高分神器啦!


总觉得将荧光图放在文章中,瞬间就找到了高大上的感觉!

上回我们给大家分享了如何用ImageJ计算划痕面积细胞计数以及western blot蛋白定量等神器技能,我们收到了许多研友们的积极反馈,感谢大家对我们的鼓励和支持!

今天我们将继续给大家分享一项后台呼声最高的科研必备技能—ImageJ之细胞荧光定量(简单6步,保证你能学会哦)

 

以计算下图荧光强度为例(同一条件下拍摄):

1、导入图片:File→open:打开要测量的荧光图



2、转换图片格式:Image→Type→16-bit (调成灰度图片,此步骤非常重要,但可根据需要调成8或32bit)

 

3、设置需测量参数:Analyze→Set Measurements

在弹出的设置选项框中勾选测量对象:1面积(Area);2平均灰度值(Mean);3累积光密度(IntDen)后,点击OK

(PS:累积光密度=面积x平均灰度值,即:IntDen=Area * Mean)

 

4、调出ROI Manager界面:Analyze→Tools→ROI Manger

   

5、在图片上选择测量对象(带荧光的细胞以及背景)并计算

a 点击主界面的套索工具

b 点击test1图,用套索工具在图上勾画出一个荧光细胞轮廓后,在ROI Manager界面点击Add,在下图框2处会出现一个对象,点中后选择框3的Rename,重命名对象,因为是测量的第一个细胞,此例按顺序重命名为1点击OK

c 按照步骤b继续用套索工具在test1图上勾选出多个测量对象,并按照顺序以及目的重命名,如:本例勾画了6个待测对象以及3个背景对象,如下图所示,选择好对象后,在ROI Manager界面中的框1处,按住shift键选择所有测量对象,然后点击框2处Measure

d点击Measure后,弹出下框结果值,其中Area列举了每个对象的面积; Mean为每个对象的平均灰度值; IntDen表示为每个对象的累积光密度

 

6 、整理数据

将步骤5得到的结果图拷贝至EXCEL表格中,由于1-6号为待测细胞,7-9号为背景对象,我们求出背景7、8、9的平均光密度后,

校正后的累积光密度=累积光密度-待测细胞面积*背景平均光密度

即IntDen(校正)=IntDen-Area*Mean(背景)

 

7、同理重复上述步骤继续测量test2或其它图片的荧光强度

将得到的结果进行整理,即可做出用于发表的图片啦,当然为了结果尽可能的准确你需要选取更多的测量对象


这次分享的ImageJ新技能,你学会了吗?你们还有哪些技能想要get呢?欢迎文末留言,小张团队将继续为您分享神器技能笔记!

 

Image J软件下载地址:

链接:http://pan.baidu.com/s/1o83LiEQ 

密码:2ojb

 

相关阅读:


参考文献:

Ramanathan S P, Helenius J, Stewart M P, et al. Cdk1-dependent mitotic enrichment of cortical myosin II promotes cell rounding against confinement.[J]. Nature Cell Biology, 2015, 17(2):148-59.


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