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ATAC-seq能干啥?看这一篇就够了 | 合成致死的ARID两兄弟是怎么分工的?

先吐槽 ~

小伙伴儿要求讲:ATAC-seq能用来解决什么样的问题?

好吧!小丫整理了研究策略干货贴:《老板让找DNA转录调控分子,这个技术十拿九稳》。


小伙伴儿又嫌干货太干,要有文章有例子。

好吧!结合文献:《表观基因组更稳定更长寿 | 这个问题是否跟表观遗传有关?先做个ATAC-seq再说


小伙伴儿又嫌ATAC-seq出场时间太晚。

于是,找小丸子推荐paper。

小丸子你是跟我有仇吗?老板说不用解读全文,只要解读带ATAC-seq的Figure就好。这篇每张Figure都带ATAC-seq(帮我找个怒吼带回音的表情)!!!


仔细一看才发现,这篇简直发挥了ATAC-seq的所有特长



分享上个月发表在eLife上的一篇文章


Chromatin accessibility underlies syntheticlethality of SWI/SNF subunits in ARID1A-mutant cancers. (Elife, 2017Oct 2, IF=8.6)


问题的提出


陈述现象

  • ARID1A是SWI/SNF染色质重塑复合物中的最大亚基,经常在各种癌症中发现它的突变。ARID1A有2个同源基因ARID1B和ARID2,也出现在SWI/SNF复合物里,但在癌症中很少见到它俩突变。

  • ARID1A和ARID1B经常共表达,互斥出现在SWI/SNF复合物里。

  • 在癌细胞系和fibroblasts里,ARID1B和ARID1A突变导致合成致死。


提出问题:

  • 为什么只有ARID1A突变在癌症中经常出现?

  • ARID1B和ARID1A的合成致死机制是怎样的?


解决方案

思路大白话

Q:从何处入手?用啥材料?

A:有对比才有发现。两个基因分别KD或KO,再一起KD或KO,加上对照组。


Q:做啥实验?这俩基因KD/KO一定会引起表观调控的变化吗?那么多组蛋白修饰,做哪个的ChIP-seq?

A:先做个ATAC-seq,就当预实验了,check一下基因KO/KD是否引起了表观基因组水平上的变化。


Q:发现开放染色质发生了剧烈变化(Fig.1),这“预实验”发现的特征有点多。继续问:什么地方变了?

A:做几个经典的组蛋白修饰的ChIP-seq,结合已发表的GRO-seq数据,发现这俩基因跟enhancer活性及其相关的histone mark有关(Fig.2和3)。


Q:既然能跟enhancer扯上关系,那么具体是哪个TF结合了这些区域,从而行使了远距离调控的enhancer功能呢?

A:祭出神器:ATAC-seq + motif,在ATAC-seq标出的差异开放区域上,找到了AP1家族转录因子的motif(Fig.4)。用已发表的AP1家族成员ChIP-seq数据验证。


Q:2个基因 + enhancer + AP1,这么丰富的调控机制,影响基因表达了吗?调控了哪些生物学通路呢?

A:RNA-seq出场,结合已发表的PolII的ChIA-PET数据,发现是因为形成了loop从而影响下游基因表达。下游基因富集在重要的癌症相关生物学通路上(Fig.5和6)。


Q:这只是在一个细胞系里发现的规律,是否具有普遍性?

A:拿另一种癌症的细胞过来验证,只做其中一个基因的ATAC-seq、ChIP-seq和RNA-seq,就看到了同样的规律。说明该作用机制具有普遍性,意义更重大。


下面是详细的图和结论:

材料:结直肠癌细胞HCT116、ARID1A KO、ARID1B KD、ARID1A KO且ARID1B KD

方法:ATAC-seq,H3K4me1、H3K4me3、H3K27ac、H3K27me3的ChIP-seq,RNA-seq

这篇文章产生了这么多数据:

还加入了这么多已发表的公共数据,DNase-seq,SMARCA4、SMARCC1、FRA1、JUND、CTCF、ATF3的ChIP-seq,POL2RA的ChIA-PET,GRO-seq:


Fig. 1

ARID1A and ARID1B have unique and shared roles in the maintenance of chromatin accessibility.

用ATAC-seq看开放染色质,用来衡量SWI/SNF的染色质重塑活性。

发现:ARID1A KO会引起染色质开放性剧烈变化,ARID1B KD就没反应;
在ARID1A KO细胞里KD ARID1B,会进一步改变“依赖于ARID1A区域”的开放状态。这解释了为什么这俩基因合成致死。

ARID1A蛋白比ARID1B含量高很多,说明ARID1A更多的参与形成SWI/SNF复合物,这部分解释了为什么癌症中更常出现ARID1A突变


Fig. 2


Requirement for ARID1A or ARID1B is determined by SWI/SNF

complex occupancy


ARID1A?还是ARID1B?由SWI/SNF复合物定位在哪里来决定。解释了为什么ARID1A和ARID1B互斥出现在SWI/SNF复合物里。



Fig. 3

ARID1A/1B-dependent accessible sites are primarily located in

enhancers


ARID1A/1B are necessary to maintain active enhancer architecture


依赖于ARID1A和ARID1B的开放区域有着高水平的SMARCA4和SMARCC1结合,很强的H3K4me1和H3K27ac富集,借助已发表的GRO-seq数据发现这些区域转录出很多enhancerRNA,这些说明ARID1A/B的缺失通过影响enhancer活性来影响开放性。


Fig. 4


ARID1A/1B are required for binding of AP-1 complex family members


前面的ATAC-seq发现了那么多差异的开放区,通过分析motif,发现了多个AP-1家族成员的motif。借助这些家族成员的已发表的ChIP-seq数据,验证了这一发现。并且发现他们结合在enhancer上,需要ARID1A和ARID1B的参与。




Fig. 5和6


ARID1A and ARID1B regulate gene expression by maintaining active

enhancer architecture


ARID1A/1B maintain transcription of genes in cancer growth promoting

pathways, including MET


上述依赖于ARID1A和ARID1B的开放区变化影响了哪些基因表达?借助已发表的PolII的ChIA-PET数据,结合RNA-seq分析发现,依赖于ARID1A和ARID1B的开放区和enhancer上的H3K27ac,是通过在TSS区跟其他调控区形成loop,来影响基因表达

ARID1A和ARID1B缺失带来的这些改变带来的差异表达基因,富集在细胞生长和粘附信号转导通路中,包括驱动细胞增殖的MET。而且在MET基因及其下游发现了大量AP1复合物和SWI/SNF复合物。

这些结果表明,SWI/SNF复合物在维持转录因子结合的开放区和活跃enhancer的组蛋白mark上起着重要作用。缺少SWI/SNF复合物会导致这些过程失调,改变癌症通路中关键基因的表达。这与ARID1A和ARID1B缺失所导致的癌细胞生长减缓的现象一致




Fig. 7

ARID1B regulates accessibility and active histone modifications at

enhancers in ARID1A mutant ovarian cancer cells


用相似的技术在自然发生ARID1A突变的卵巢癌细胞系里KD ARID1B,观察到的现象与上述HCT116中的一致。说明这是多种癌症类型共有的普遍调控机制。

结论该研究阐明了ARID1A和ARID1B在维持染色质开放性中的功能,确定ARID1A及其合成致死基因ARID1B通过调控核小体重塑,从而发挥抑癌作用。


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