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零基础实验| Western blot操作流程

实验是很多临床同学永远的痛,相比基础的同学,也许是先天不足,而对于基础实验中最基本的WB应该是必须知道的,今天就向大家介绍———–western blot

先来个生动温馨的小视频~


视频中展现的即

western blot

➪ 蛋白免疫印迹法的操作流程。

  下面我们来具体感受一下western blot技术~



在蛋白免疫印迹法(Western Blotting)是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术, 用来检测特定样本或提取物中的某种特定蛋白  此技术首先利用电泳技术将不同分子量蛋白分离,然后转移至硝酸纤维素(NC)膜或聚偏二氣乙烯(PVDF)膜上,利用抗原抗体结合并染色的原理, 检测特定蛋白的表达量。 免疫印迹法是生物学中最常用的一种实验手段 

知识回顾

以上所提到的抗原抗体结合大家一定不陌生,我们在高中生物所学的基因工程的最后一步:目的基因的检测与鉴定方法中涉及到过。

实验原理

western blot

western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

实验步骤

1

蛋白样品制备(组织中总蛋白的提取)

第一步

检测蛋白,当然先要把被检测的对象蛋白提取出来。

我们的做法为:向细胞中直接加入蛋白裂解液,组织需要先用匀浆器将组织研磨成匀浆,再进行后续处理。

此时细胞或组织经特定裂解缓冲液裂解后会释放目的蛋白。

法(1)敲取0.07-0.1g组织+400-500ul裂解液,放入打样管,放入打样机打样。

法(2)实验室研钵研磨:取稍大于0.1g的样品放入研钵中,来回磨,至粉末状,用枪头刮取收集入离心管。

注:任何操作都要在液氮中进行,并且要将枪头和离心管提前泡在液氮中。


第二步 


取出的样品放置冰上1-2h(中间混匀5-6次)直至裂解完全。

 第三步


样品离心*2,取上清于新的EP管中。

(离心条件:13000rpm,4℃,30min)


  注:离心机提前预冷至4℃。

2
  蛋白质含量的测定
提取出蛋白质后,来测一下样品的蛋白含量吧。

第一步:在96孔板第一列1-8分别为浓度为0、1、2、4、6、8、9、10倍的蛋白标准液+水=10或20ml,再加上5倍稀释的考马斯亮蓝染液200ml。

   第二步:在96孔板后面几列依次加入稀释的蛋白样品或原液10-20ml以及5倍稀释的考马斯亮蓝染液200ml。

注:原液浓度太高时进行稀释,用裂解液稀释。

3
  电泳

在做完蛋白质准备工作后,重头戏:电泳coming!

电泳采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,意义在于分离不同分子量的蛋白,是western blot的核心技术之一。

电泳时需要设计好加样顺序,做好实验记录,按照预定顺序加样。我们来看一下具体操作流程。

第一步:清洗玻璃板

第二步:配胶

(1)玻璃板对齐后放入夹中卡紧,然后垂直卡在架子上准备灌胶。

(2)配分离胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。待胶面升到玻璃板3/4位置时即可。然后胶上加一层水,液封后的胶凝的更快。

注:加水液封时要很慢,否则胶会被冲变型。

(3)当水和胶之间有一条折射线时,说明胶已凝了。倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。配浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。待到浓缩胶凝固后,两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。

注:插梳子时要使梳子保持水平。

没想到吧,

梳子还能这样用


(4)用水冲洗一下浓缩胶,将其放入电泳槽中。(小玻璃板面向内,大玻璃板面向外。若只跑一块胶,槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。

第三步:上样

(1)测完蛋白含量后,计算含50mg蛋白的溶液体积即为上样量。适量蛋白加入4:1 5*Loading Buffer于离心管,100℃水中煮5min使蛋白变性。放置冰上3min,离心15min,13000rpm,4℃。

(2)加足够的1*电泳缓冲液后开始准备上样。(电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。)用微量进样器贴壁吸取样品,将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。(加样太快可使样品冲出加样孔,若有气泡也可能使样品溢出。)

第四步:电泳

浓缩胶70V电压跑30分钟,可多跑几分钟;分离胶110V电压跑至底端。

第五步:停止电泳

纯水冲洗玻璃板,取胶,清洗切去浓缩胶,将胶泡在1*转膜液中。

4
  转膜

(跑胶时准备转膜用品,最主要赶气泡

经电泳分离后的蛋白质样品,需要转移到固相载体上,用于吸附蛋白质,并保持电泳分离的多肽类型及其生物活性不变。 采用滤纸/胶/膜/滤纸的三明治模式进行转膜。

三明治——面包肉片煎蛋生菜西红柿?

Nonono……

是 海绵、滤纸、凝胶、NC膜、滤纸、海绵 。

而且顺序不能反哦 ✦

操作如下

 第一步:剪PVDF膜,并提前切个角,甲醇中泡30s。

 第二步:将膜、海绵、滤纸一起泡入1*转膜液中保存。

注:转膜液可回收。

  第三步:将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫,用玻璃棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。(一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。)在垫子上垫2层滤纸,一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。将胶盖于滤纸上,轻轻用玻棒擀去气泡。将膜用镊子盖于胶上,并除气泡。在膜上盖2层滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫,合起夹子。


整个操作在1*转膜液中进行,要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触,接触后会发生短路。

擀面杖


想想你是

怎么用它的







    第四步:将夹子放入转膜槽槽中,黑对黑,红对红。电转移时会产热,过热有可能造成蛋白质的降解,同时大量产热,会使凝胶膨胀,有可能在胶和膜之间产生空隙,引起转膜不均匀,所以在转膜槽外放冰盒,在冰水混合物中进行转膜。







注:转膜条件是电流200mA或电压110V,2h;另一个约束条件就是电压必须控制在60-70V,调节电流。

 第五步:转完后将膜放入装水的小盒中冲洗,倒水后,加5%的封闭液,摇床封闭2h。 防止产生高背景信号,封闭是利用利用脱脂奶粉或 BSA。

5
  抗体孵育,免疫反应


第一步:回收封闭液,加入一抗,摇床4℃过夜。

第二步:一抗孵育。配置特定浓度的一抗稀释液,与膜进行孵育, 一抗会与膜上目的蛋白进行特异性结合。


第三步:一抗孵育结束后,与特定浓度的二抗进行孵育结合。二抗带 HRP或 AP标记。

第四步:二抗回收,用PBST洗,洗5次,每次5min。(少时多次)

第五步:化学发光显影,曝光/成像。纯水冲洗5-7次,倒掉纯水,加化学发光,膜在化学发光中浸泡2-3min,成像。曝光成像后,转换数据进行分析。



生物与化学碰撞,蹭出完美的火花~

有了western blotting,未知的蛋白性质手到擒来。检测蛋白质特性与表达不再惆怅


get到了分析容量大、敏感度高、特异性的杂交技术,你对实验室的期待是不是又多了一分呢?

来源:“生命青年传媒中心”公众号

作者:焦琳菲


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