SCI医学科研助手
生信分析-Meta分析-基础实验

干货|分子生物学之常用试剂配制方法

 

生物学问题最终都要通过实验解决的,因此学会基本的生物学实验是至关重要的。今天小编讲一下常用试剂配置的方法及注意事项。

首先必须理解几个问题,分子生物学试验所用的谁都是去离子水级别的,所以器皿都要用去离子水冲洗;烧杯、量程大的量筒刻度是不准确的,不能用作定量的器皿,只能进行大体估量;配制好药品的及时贴标签标注:试剂名称、配制日期、配制人;加热促溶解设备:电炉,磁力搅拌器,微波炉,水浴锅。

 

一、电泳类试剂

1.50×Tris-乙酸(TAE,pH=8.5)缓冲液

成分及终浓度

配制100mL溶液各成分的用量

 2mol/L Tris碱
 1mol/L 乙酸
 100 mmol/L EDTA
 水

 24.2g
 5.71 mL的冰乙酸(17.4 mol/L)
 3.72gNa2EDTA·2H2O
 补足100mL

【注意事项】

1.各物质的称量务必准确,以确保缓冲液处于最佳状态。

2.不要使用实验室已配制的Tris缓冲液来配制2mol/L Tris碱,因为实验室常见的Tris缓冲液往往使用了HCl调节了pH,成为了Tris-HCl缓冲液,而此处是使用纯Tris,配制Tris-乙酸缓冲液。下述TBE中同样也是不可用Tris-HCl缓冲液来配制。

2.5×Tris-硼酸(TBE)缓冲液

成分及终浓度

配制1L溶液各成分的用量

 445 mmol/L Tris碱
 445 mmol/L 硼酸盐
 10 mmol/L EDTA
 水

 54g
 27.5g 硼酸
 3.72 g Na2EDTA·2H2O(pH  8.0)
 补足1L

【注意事项】

1.TBE溶液长时间存放后会形成沉淀物,为避免这一问题,可在室温下用玻璃瓶保存5倍的溶液,使用0.5倍的稀释液。

3.6×loading buffer 室温保存

在0.6%、1%、2%的琼脂糖凝胶电泳中它们分别与1kb、0.6kb、0.15kb的双链DNA片断的泳动率大致相同。

【注意事项】

1.该缓冲液用于DNA电泳;

2.该缓冲液中含色素溴酚蓝(BromophenolBlue)、二甲苯腈蓝FF(Xylene Cyanol FF)两种染料(浓度都是0.05%),溴酚蓝在琼脂糖凝胶(0.5% ~ 1.4%)中约与300 bp的双链线状DNA的迁移速度相同,而二甲苯腈蓝FF则与4 kbp的双链线状DNA的迁移速度相等。

4.10×loading buffer

【注意】

1.适合于RNA电泳。

2. 制品中含有SDS, 可即刻停止各种酶促反应。向酶促反应液中加入1/10量的本制品,即可停止反应,此溶液可直接用于琼脂糖凝胶电泳。

3.10X loading buffer 中仅有色素溴酚蓝(Bromophenol Blue)一种染料(浓度0.05%)。

 

二、培养基类

1.LB培养基
(1)将下列组分溶解在0.9L水中:

蛋白胨

10g

酵母提取物

5g

氯化钠

10g

如果需要用4M NaOH(约0.5mL)调整pH至7.0,再补足水至1L。然后分装于250mL锥形瓶并用泡沫或棉塞或封口膜进行封口,121℃灭菌15—20min

(2)固体培养基

在液体培养基的基础上,加入7g琼脂粉并煮沸,调节pH后定容至1L。

【注意事项】

1.胰蛋白胨和酵母提取粉易粘连称量纸,故称量完成后将称量纸与药品一起放到去离子水中,然后在加热过程中将称量纸上的药品清洗干净取出。

2.用双层封口膜封口灭菌。

3.只要培养基保持澄清状态,其可认为是无菌的,可以继续使用。

2.MS培养基

母液种类

成分

规定用量/(mg·L-1

称取量/mg

 

配制体积/mL

 

扩大倍数

配1L MS培养基吸取量/mL

大量元素

KNO3

1900

19000

500

20×

50

NH4NO3

1650

16500

MgSO4·7H2O

370

3700

KH2PO4

170

1700

CaCl2·2H2O

440

4400

微量元素

MnSO4·4H2O

22.3

1115

500

100×

10

ZnSO4·7H2O

8.6

430

H3BO3

6.2

310

KI

0.83

41.5

Na2MoO4·2H2O

0.25

12.5

CuSO4·5H2O

0.025

1.25

CoCl2·6H2O

0.025

1.25

铁盐

Na2-EDTA

37.3

1685

250

200×

5

FeSO4·7H2O

27.8

1390

维生素和氨基酸

甘氨酸

2.0

100

500

100×

10

盐酸硫胺素(VB1

0.4

20

盐酸吡哆素(VB6

0.5

25

烟酸

0.5

25

肌醇

100

5000

注:阴影的两种试剂单独配制成200×的,否则大量元素容易形成沉淀

三 抗生素类

简介

1.抗生素溶液的配置一般用无菌水或醇类充当溶剂。

2.以乙醇为溶剂的抗生素溶液无须除菌处理,用无菌水配的用0.45或0.22um无菌过滤器过滤除菌(个人经验,只要将盛装抗生素溶液的容器灭菌处理后可不用过滤除菌)。

3.所有抗生素溶液均应放于不透光的容器保存,也可用锡箔纸包裹。

4.镁离子是四环素的拮抗剂,四环素抗性菌的筛选应使用不含镁盐的培养基(如LB培养基)。

5.抗生素配制出以后4℃可保存3个月,-20℃可保存一年。

6.配制完成后注意分装。

常用抗生素

1.氨苄青霉素(Amp)(100mg/mL)
溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的无菌水中,最后定容至10mL,必要时可以用0.45或0.22um无菌过滤器过滤。分装成小份于-20℃可贮存一年,4℃可贮存3个月。常以25ug/mL~50ug/mL的终浓度添加于生长培养基。

2.羧苄青霉素(Car)(50mg/mL)
溶解0.5g羧苄青霉素二钠盐于足量的水中,最后定容至10mL。分装成小份于-20℃贮存。常以25ug/mL~50ug/mL的终浓度添加于生长培养基。

3.甲氧西林(Met)(100mg/mL)
溶解1g甲氧西林钠于足量的水中,最后定容至10mL。分装成小份于-20℃贮存。常以37.5ug/mL终浓度与100ug/mL氨苄青霉素一起添加于生长培养基。

4.硫酸卡那霉素(kan)(10mg/mL)
溶解100mg卡那霉素于足量的无菌水中,最后定容至10mL。分装成小份于-20℃贮存。常以10ug/mL~50ug/mL的终浓度添加于生长培养基。

5.氯霉素(Chl)(25mg/mL) 
溶解250mg氯霉素足量的无水乙醇中,最后定容至10mL。分装成小份于-20℃贮存。常以12.5ug/mL~25ug/mL的终浓度添加于生长培养基。

6.链霉素(streptomycin)(50mg/mL)
溶解0.5g链霉素硫酸盐于足量的无水乙醇中,最后定容至10mL。分装成小份于-20℃贮存。常以10ug/mL~50ug/mL的终浓度添加于生长培养基。

7.萘啶酮酸(nalidixic acid)(5mg/mL)
溶解50mg萘啶酮酸钠盐于足量的水中,最后定容至10mL。分装成小份于-20℃贮存。常以15ug/mL的终浓度添加于生长培养基。

8.四环素(tetracyyline)(10mg/mL)
溶解100mg四环素盐酸盐于足量的水中,或者将无碱的四环素溶于无水乙醇,定容至10mL。分装成小份用铝箔包裹装液管以免溶液见光,于-20℃贮存。常以10ug/mL~50ug/mL的终浓度添加于生长培养基。

[注意事项]

1.不能高温灭菌的抗生素必须采用过滤灭菌。

2.以乙醇为溶剂的抗生素溶液无须除菌处理。所有抗生素溶液均应放于不透光的容器保存。

3.镁离子是四环素的拮抗剂,四环素抗性菌的筛选应使用不含镁盐的培养基(如LB培养基)。

 

四、核酸提取类

 

1. 10%十二烷基硫酸钠(SDS)溶液

配制量:100mL

[配制方法]在90mL无菌水中溶解10g电泳级SDS,加热至68℃助溶,加入几滴浓盐酸调节溶液的pH值至7.2,加水定容至1L,分装备用。

[注意事项]

1.SDS的微细晶粒易扩散,因此称量时要戴面罩,称量完毕后要清除残留在称量工作区和天平上的SDS,10%SDS溶液无须灭菌(高温条件下分解会产生CO等有毒气体)。

2.若有沉淀形成,可以适当水浴加热溶解后继续使用。

3.区别于十二烷基磺酸钠。

4.pH极易调过需小心

2.1%DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水

配制量:1L

[配制方法]加1mL DEPC 于 999ml水中,用磁力搅拌器在37℃条件下搅拌4h以上,静置过夜,在121℃ 条件下高温灭菌20min,以使残余的DEPC失活。

[注意事项]

1.DEPC具有强烈的致癌性,故操作时必须戴双层口罩,双层手套于通风厨中进行。

2.此处配制的DEPC水用于RNA提取中70%乙醇的配制及RNA的溶解。

3.TE缓冲液

配制量:100mL。

【配制方法】:量取下列溶液于100mL烧杯中

成分及终浓度

配制100mL溶液各成分的用量

10mmol/L Tris-HCl
 1mmol/L EDTA
  

1mL 1mol/L Tris-HCl(pH8.0,25℃)
 200ul 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)

然后向烧杯中加入80mL去离子水,均匀混合,最后定容至100mL,高温高温高压灭菌后使用。

用途:用于悬浮和贮存DNA

保存:室温长期保存。

4.1MTris缓冲液(Tris-HCl buffer)

配制量:100mL。

【配制方法将12.1g的Tris碱溶解于约70mL去离子水中,适当加热溶解,再根据所要求的pH(25℃下)加一定量的浓盐酸(11.6N),用水调整终体积至100mL。

浓盐酸的体积(mL)

pH

0.86
 1.4
 2.1
 2.85
 3.8
 4.6
 5.6
 6.6
 7.13
 7.6

9.0
 8.8
 8.6
 8.4
 8.2
 8.0
 7.8
 7.6
 7.4
 7.2

【注意事项】

1.称量时应戴口罩,避免吸入Tris粉末。

2.应使溶液冷却至室温时再调PH值,因为溶液的PH值随温度的变化差异很大,温度每升高1℃,溶液的pH值大约降低0.03个单位。

3.溶液若呈现黄色,则暗含该Tris质量较差,质量较差,不应使用。

4.很多类型的PH计的电极不适合精确测量其PH值,故根据说明书选择合适的电极。

保存:室温可长期保存。

附:温度对50mmol/L Tris·HCl液pH值的影响

4℃

25℃

37℃

8.1

7.5

7.2

8.2

7.6

7.3

8.3

7.7

7.4

8.4

7.8

7.5

8.5

7.9

7.6

8.6

8.0

7.7

8.7

8.1

7.8

8.8

8.2

7.9

 

5. 3M醋酸钠(PH 5.2)

配制量:100mL。

【配制方法】:称取40.8gNaOAc.3H2O置于100mL烧杯中,加入约40mL去离子水搅拌溶解,然后用冰醋酸调Ph至5.2,最后定容至100mL,高温高温高压灭菌后使用

保存条件:室温保存。

【注意事项】:

1.此溶液常用于沉淀DNA,中和磷酸基团的负电荷,当其pH低于5.0时不可使用。

2.配制时加入去离子水为40ml因为冰醋酸调节pH时需要的冰醋酸量较大,故为保证最后不超过定容体积,去离子水不易加入过多。
6. 10M醋酸铵

配制量:100mL。

【配制方法】:称取77.1g醋酸铵于100mL烧杯中,加入约80mL无菌水搅拌溶解,然后定容至100mL。

保存条件:棕色瓶盛装,密封室温保存。

注意事项】:醋酸铵受热易分解,故不能高温高压灭菌。

7.苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)

按24:1的体积比配置适量的氯仿异丙醇,然后加入与氯仿异戊醇(24:1)等体积的Tris-Hcl平衡酚,最后加入适量的无菌水密封即可

保存条件:棕色瓶,4℃保存。

注意事项】:氯仿、Tris-Hcl平衡酚,异戊醇均为有毒物质,操作时应戴好口罩和手套,最好再通风厨中进行!

8. 2N NaOH

配制量:100mL。

配制方法】:用小烧杯称取8g NaOH(其易潮解故用小烧杯称取)加入约80mL去离子水搅拌溶解,然后定容至100mL。

保存条件:非磨口玻璃瓶,室温保存。

2.5N HCl

配制量:100mL。

【配制方法】:在78.4mL去离子水中加入21.6mL的浓盐酸(11.6N),均匀混合。

保存方法:室温保存。

【注意事项】戴手套,口罩操作,最好再通风厨中进行!

9. 5M NaCl

配制量:100mL。

【配制方法】:称取29.22g氯化钠于100mL烧杯中,加入约80mL去离子水加热搅拌溶解,最后定容至100mL,高温高压灭菌后使用。

保存条件:4℃保存。

10.溶液I

1mol/L HCl:加8.6mL的浓盐酸至91.4mL的水中

2.5% X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷):溶解25mg的X-gal于1mL的二甲基甲酰胺(DMF),用铝箔包裹装液管,贮存于-20℃。
11.1M CaCl2溶液

【配制方法】在200mL蒸馏水中溶解54gCaCl2·6H2O,用0.22μm滤器过滤除菌,分装成10mL小份贮存于-20℃。

【注意】制备感受态细胞时,取出一小份解冻并用蒸馏水稀释至100mL,用Nalgene滤器(0.45μm孔径)过滤除菌,然后骤冷至0℃。

12.0.5mol/l EDTA(pH8.0)溶液

配制量:100mL

【配制方法】在80mL水中加入18.612g二水乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2·2H2O),在磁力搅拌器上剧烈搅拌,用NaOH调节溶液的pH值至8.0(约需2.2g NaOH颗粒)然后定容至100mL,分装后高温高压灭菌备用。

保存:室温长期保存。

【注意】EDTA二钠盐需加入NaOH将溶液的pH值调至接近8.0,才能完全溶解。而且配制时最好使用EDTA钠盐(其较易溶于水,而EDTA较难溶于水,易溶于有机溶剂)。

13.5M乙酸钾

【配制方法】将98.14g乙酸钾溶解于160mL去离子水中,然后定容至200mL。

保存:室温长期保存。

14.溶液Ⅰ(GTE)

配制量:100mL

【配制方法】:将0.99685g葡糖糖、2.5mL的1M Tris(pH=8.0)和2mL的0.5M EDTA(pH=8.0)混合然后加水定容至100mL,高温高压灭菌后使用。

保存:4℃长期保存。

【注意事项】此溶液最好在115℃高温灭菌,葡萄糖在121℃容易碳化。

15.溶液Ⅱ(1%SDS/0.2NNaOH)

配制量:10mL。

【配制方法】:取1mL10%SDS和0.5mL的4N NaOH混合后用无菌水定容至10mL。

保存:室温保存,现配现用。

【注意】

1.溶液要现配现用。

2.在较低的温度下可能会形成沉淀,使用时加热溶液并缓缓摇动使沉淀溶解。

3.SDS易产生气泡,定容时应缓慢转移。

16.溶液Ⅲ(乙酸/乙酸钾溶液)

配制量:100mL。

【配制方法】

在60mL 5mol/L乙酸钾溶液中加入11.5mL冰乙酸和28.5mL去离子水,即成钾浓度为3mol/L而乙酸根浓度为5mol/L的溶液。高温高压灭菌后使用。

保存:4℃长期保存。

【注意】

1.注意同乙酸钾的区别。

2.在4℃保存,能够在小提质粒时起到预冷的作用。

17.2%CTAB提取液

【配制量】 100mL

【配制方法】

2%      CTAB     2g

1400mM  NaCl     8.182 g

100mM   Tris-HCl1.212g( PH8.0)

20mMM   EDTA     4mL(0.5M)(0.585g),先用90mL ddH2O溶解, 再定容至100mL灭菌,冷却后0.2mL β-巯基乙醇

【注意】2-巯基乙醇不能高温灭菌,故必须灭菌冷却后加入。冬季此溶液会出现沉淀,使用65℃加热溶解沉淀(注意温度不宜过高)。

19.酚/氯仿溶液

【配制方法】把tris平衡酚和氯仿等体积混合后用无菌水密封,保存于4℃。

【注意】酚腐蚀性很强,并可引起严重灼伤,操作时应戴手套及防护镜,穿防护服。所有操作均应在通风橱中进行。与酚接触过的部位皮肤应用大量的水清洗,并用肥皂和水洗涤,忌用乙醇。

20.细胞提取液(适用于SDS法提取DNA)

【配制量】100mL

100mM  Tris-HCl 1.212g( pH 8.0)

5 mM   EDTA    1mL(0.5M)(0.1463g)

500mM  NaCl    2.922g

1.25%   SDS     12.5mL(10%SDS)(0.125g)

1mL     β-巯基乙醇

【注意事项】此溶液配制建议全部使用无菌水配置,然后定容,可以免去高温灭菌。β-巯基乙醇不能高温灭菌,故必须灭菌冷却后加入。SDS不能高温灭菌,必须用无菌水配制的;冬季此溶液会出现沉淀,使用68℃加热溶解沉淀(注意不要温度过高)。

四、Southern杂交类

1.20×SSC溶液

配制量:1L

【配制方法】在800mL水中溶解175.3gNaCl和88.2g柠檬酸钠,加入数滴NaOH溶液调节pH值至7.0,加水定容至1L,分装后高温高压灭菌。

【注意】称量时可选用托盘天平。

2.变性液

【配制方法】:称取43.83gNaCl(1.5M)和10g NaOH(0.5N)于400mL去离子水中磁力加热搅拌溶解,最后定容至500mL,高温高压灭菌后使用。

【注意】NaOH易潮解称取时应使用小烧杯。应用于带正电荷尼龙膜的碱性转移

3.中和液(只用于碱性转移)

配制量:500mL

【配制方法】:称取60.57gTris(1.0M)于烧杯中磁力搅拌溶解(勿加热),然后用浓盐酸(大约需15—20mL)调pH至7.4,在另一烧杯溶解43.83gNaCl(1.5M)最后定容至500mL,高温高压灭菌后使用。

用途

4.2×SSC,0.1%SDS

配制量:100mL

【配制方法】取10mL的20×SSC和1mL的10%的SDS于烧杯中,加无菌水定容至100mL即可。

注意事项:溶液配制质时易产生泡沫的,操作勿快,防止产生泡沫SDS

本文供稿:王同学


 欢迎关注生信人


 收藏 (0) 打赏

您可以选择一种方式赞助本站

支付宝扫一扫赞助

微信钱包扫描赞助

未经允许不得转载:医学SCI科研之家 » 干货|分子生物学之常用试剂配制方法

评论 抢沙发

  • QQ号
  • 昵称 (必填)
  • 邮箱 (必填)
  • 网址

学习、交流、分享

生信分析交流群综合科研交流群

登录

忘记密码 ?

切换登录

注册